Etiologie TSE
V současné době se za původce TSE považují priony. Termínem prion se rozumí infekční patogenní bílkovina se zvláštní molekulární strukturou a s doposud ne zcela objasněnými mechanismy replikace a patogeneze. Priony se od virů odlišují zejména tím, že nevyvolávají imunitní odezvu a že v infekčních částicích nebyla zjištěna žádná nukleová kyselina. Jedinou jejich známou komponentou je prionový protein (PrP).
Infekční příčina onemocnění TSE byla prokázána Prof. C. Gajduskem, patologem slovenského původu žijícím v USA, který již v roce 1957 poukázal na přenos nemoci KURU prostřednictvím rituálního kanibalismu mozku zemřelých domorodců na Nové Guinei. V roce 1966 tuto svoji teorii prokázal úspěšným přenosem KURU z mozku zemřelého domorodce na šimpanze. TSE byly od té doby zahrnuty do skupiny infekčních onemocnění způsobovaných nekonvenčním agens s dlouhou inkubační dobou (pomalé virové infekce – slow virus infections). Vlastní průkaz infekčního agens však po dlouhou dobu nebyl úspěšný. V r. 1982 byla Prusinerem a spol. vytvořena teorie prionů – infekčních, vysoce rezistentních bílkovinných molekul, jakožto zcela nových původců infekčních onemocnění. Za vytvoření prionové teorie získal Prusiner v roce 1997 Nobelovu cenu.
Dnes je známo, že tzv. infekční prion je patologická isoforma (PrPSc) prionového celulárního proteinu (PrPC). PrPSc se vyznačuje vysokou rezistencí vůči fyzikálním a chemickým vlivům. Teplotu 121°C přežívá 1 hodinu, teplotu 240°C 1 minutu. Formalinová fixace ještě zvyšuje tepelnou rezistenci tkáně. Většina obvyklých dezinfekčních prostředků je v běžně používaných koncentracích neúčinná. Snížení infektivity lze dosáhnout použitím 2% hypochloridů působících po dobu 24 hodin nebo 4% NaOH po dobu 1 hodiny. Účinnou metodou je autoklavizace při teplotě 134°C, tlaku 3 atmosfér a době působení 20 minut.
Patogeneze
Prionový celulární protein (PrPC) je přirozeně se vyskytující bílkovina membrán gangliových mozkových buněk, jež je tělu vlastní. Syntéza této bílkoviny je geneticky kódována specifickým prion-proteinovým genem (PrNP). Fyziologickou úlohou PrPC je pravděpodobně účast na regulaci procesů spánku a bdění a na udržování homeostatických mechanismů organismu. Z dosud neobjasněných příčin může PrPC prodělat konformační změnu v patologickou izoformu PrPSc. Molekulární mechanismy patogeneze PrPSc nejsou známy, mají však souvislost s obtížnou degradovatelností této molekuly. Primární struktura PrpC a PrPSc je shodná, liší se však sekundární strukturou (prostorovým uspořádáním molekuly). Sekundární struktura zaujímá u PrPC ze 42% strukturu a - helixu, u PrPSc zaujímá ze 41% strukturu b - skládaného listu. Tato změna prostorového uspořádání molekuly má zásadní vliv na její vlastnosti. PrPSc díky ní získává extrémní odolnost vůči chemickým a fyzikálním vlivům a účinkům proteáz .
Sekundární struktura molekuly fyziologické (a) a patologické formy (b) molekuly prionového proteinu, zodpovědná za její fyzikálně - chemické vlastnosti.
Epizootologie
K BSE je vnímavý skot všech plemen, i když převážná část případů byla zaznamenána u mléčného skotu, zejména holštýnského plemene. Podrobná epizootologická šetření ukázala, že zdrojem infekce BSE u skotu bylo zkrmování masokostních mouček, obsahujících infekční materiál z ovcí nemocných scrapie. Začátek zkrmování těchto koncentrátů živočišné bílkoviny skotu s cílem zvýšení jeho produkce spadá do přelomu roku 1981/82. Nástup onemocnění v letech 1985/86 odpovídá později zjištěné inkubační době.
Předpokládá se, že prostřednictvím masokostní moučky se do populace skotu mohl dostat původce scrapie, který odolal kafilernímu zpracování biologického odpadu. V dalších letech se pak toto vysoce rezistentní agens šířilo v chovech skotu zkrmováním bílkovinných koncentrátů zpracovaných rovněž ze skotu uhynulého na BSE. Po odhalení těchto zdrojů a cest šíření byl v roce 1988 vydán přísný zákaz zkrmování masokostních mouček přežvýkavcům , což mělo na přelomu roku 1992/93 za následek výrazný pokles incidence onemocnění.
Důležitým poznatkem pro boj proti BSE byla skutečnost, že nebyl prokázán přímý přenos infekce kontaktem, ani vertikální přenos z matky na potomstvo, při embryotransferu, spermatem apod. Výskyt BSE nemá souvislost s přítomností ovcí na farmě. Pro BSE je charakteristické, že nepostihuje všechna zvířata ve stádě, ale pouze jednotlivé kusy. V 65% případů onemocní jen 1 až 2 zvířata ve stádě a jen velmi zřídka onemocní více než 3 kusy. Nejčastěji bývají postižena zvířata ve věku 4 až 5 roků s hraničními hodnotami 22 měsíců až 15 roků. Vyhodnocením nemocnosti ve Velké Británii koncem r. 2000 bylo zjištěno, že 98% pozitivních zvířat bylo starších 40 měsíců.
Klinické příznaky BSE
Inkubační doba bovinní spongiformní encefalopatie je velmi dlouhá a pohybuje se v rozmezí od 2 do 8 roků s průměrem 3 - 6 let. Věk nejmladšího zvířete nemocného BSE byl 22 měsíců .
Klinické příznaky BSE lze rozdělit na poruchy psychiky a temperamentu zvířat, změny motorických funkcí, poruchy vegetativních funkcí a somatické změny.
Začátky onemocnění bývají nevýrazné a projevují se nejčastěji změnou chování zvířete. Postižené kusy jsou neklidné, lekavé, s pocity strachu a předrážděnosti. Často narušují běžný režim ve stáji - napadají jiná zvířata, odmítají vstoupit do dojírny, někdy mívají záchvaty kopání, zívání apod. Brzy nastupují poruchy koordinace a slabost pánevních končetin. Nemocné krávy stojí často s nízko skloněnou hlavou, uši směřují kaudálně a krk je natažen. Při chůzi bývá pozorováno vysoké našlapování a ataxie pánevních končetin. Nervové onemocnění je doprovázeno všeobecnými klinickými příznaky, jako jsou ztráta tělesné kondice, snižování živé hmotnosti a pokles dojivosti. Ke konci onemocnění může ataxie postihnout i hrudní končetiny, zvířata upadnou a těžce vstávají. Délka onemocnění se pohybuje v rozmezí od 2 týdnů do 6 i více měsíců, průměrně však 1 - 2 měsíce a končí vždy úhynem zvířete.
Imunohistochemické vyšetření
Imunohistochemickým vyšetřením lze prokázat akumulaci PrPSc v mozkové tkáni při možnosti současného zjištění charakteristických histopatologických změn. Tato metoda je v současné době považována za nejspolehlivější a je využívána jako konfirmační test k potvrzení nebo vyloučení diagnózy TSE, stanovené na základě výsledku některé z rychlých metod vyšetřování .
Metoda imunohistochemického vyšetření má některá specifika, která ji činí nevhodnou pro vyšetřování velkých objemů vzorků. Jsou to především:
· vysoká pracnost a náročnost na precizní provedení
· potřeba speciálně vybavené laboratoře pro imunohistochemii
· dlouhá doba potřebná k vyšetření (4 až 5 dnů)
· finanční náročnost
Vlastním principem imunohistochemického vyšetření je specifická vazba monoklonální anti-PrP protilátky na PrPSc v mozkové tkáni , s následnou vizualizací této vazby pomocí sekundární protilátky značené chromogenem. Metoda má více variant lišících se postupem zpracování vzorků a typem použitých protilátek.
Další využití imunohistochemické metody pro intravitální diagnostiku TSE je možné u některých druhů zvířat, především u ovcí, koz a jelenovitých. Jedná se o možnost detekce PrPSc v lymfatické tkáni třetího víčka, která je snadno přístupná k biopsii. Téměř konstantní výskyt v lymfatických tkáních byl popsán u zmíněných živočišných druhů, a to týdny až měsíce před výskytem PrPSc v mozku a nástupem klinických příznaků. U skotu a koček se však tato metoda jeví jako nespolehlivá, neboť výskyt PrPSc v mízních tkáních není v mnoha případech zjištěn ani u klinicky nemocných jedinců.
Western - blot (fy Prionics - Check)
Western - blotting je jednou z rychlých diagnostických metod pro detekci PrPSc v mozkové tkáni. V současné době je tato metoda v Evropě nejrozšířenější, v České republice je používána ve Státních veterinárních ústavech v Jihlavě a v Praze. Metoda vyniká vysokou specifitou a citlivostí. Výsledky vyšetření jsou k dispozici přibližně za 8 hodin, v závislosti na počtu vyšetřovaných vzorků. Metodou Western - blot byly detekovány oba doposud zjištěné pozitivní případy BSE v ČR.
Předpokladem pro provádění vyšetření metodou Western - blot je speciálně vybavené pracoviště se zaškoleným personálem. Metoda je materiálově a finančně velmi náročná, výhodou je však možnost vyšetření menšího počtu vzorků. Výsledky vyšetření jsou snadno dokumentovatelné, s možností zpětné kontroly po dlouhém časovém období.
Princip metody je založen na rezistenci PrPSc vůči působení proteázy K, s možností jeho následné imunochemické detekce. Vzorek mozkové tkáně o hmotnosti 0,5 g, odebraný z regio obex prodloužené míchy, je zhomogenizován při 20 000 otáčkách v desetinásobném objemu homogenizačního pufru. Získaná suspenze mozkové tkáně je podrobena trávení proteázou K při 47°C. Účinkem proteázy je zcela denaturován fyziologický PrPC, zatímco u PrPSc dochází pouze k částečnému natrávení a změně molekulové hmotnosti z původních 32 - 35 kDa na 27 - 30 kDa (PrP27-30). Následuje naředění vzorkovým pufrem a separace bílkovin vertikální elektroforézou v polyakrylamidovém gelu podle molekulové hmotnosti. Z gelu jsou separované bílkoviny přeblotovány na PVDF membránu, na níž je přítomnost fragmentu PrP27-30 detekována vazbou monoklonálních myších protilátek, s následným převrstvením značenou kozí anti - myší protilátkou. Po přidání substrátu dochází k vyzáření světelného kvanta, jež lze zachytit expozicí na chemiluminiscenční film, příp. speciálním elektronickým snímacím zařízením. V případě pozitivního vzorku je na filmu zachycena světelná stopa v lokalizaci odpovídající molekulové hmotnosti 27 - 30 kDa, rozdělená na 3 charakteristické bandy odpovídající jeho di-glykosilované, mono-glykosilované a neglykosylované formě. Vyšší senzitivita a specifita vyšetření je zajištěna dvojím nanesením každého vzorku od začátku vyšetření.
Pracovní režim v laboratoři BSE musí odpovídat požadavkům na práci s rizikovým biologickým materiálem II. třídy nebezpečnosti. Vstup do laboratoře je oddělen hygienickou smyčkou (air lock systém) od okolního prostředí. Personál je povinen používat jednorázové pracovní pomůcky (pláště, roušky, rukavice) po celou dobu pobytu v laboratoři. Veškerá manipulace s vyšetřovaným biologickým materiálem probíhá v laminárních boxech třídy biohazard II. Spotřební materiál je používán jednorázově a po použití a dekontaminaci autoklávováním je spálen. Použité pracovní roztoky a vyšetřovaný materiál jsou uchovávány až do ukončení vyšetření vzorků z důvodu případné nutné dekontaminace, jež je prováděna 4% NaOH po dobu minimálně 1 hodiny. Dekontaminace pracovních ploch je prováděna 2% roztokem chlornanu.
Vzorky prodloužené míchy určené k vyšetření jsou odebírány na jatkách či v asanačních ústavech pověřeným státním veterinárním lékařem přes foramen magnum pomocí speciálně upravené ostré lžíce, kterou je provedeno odříznutí požadované části nervové tkáně, zahrnující celou prodlouženou míchu, část středního mozku a mozečku. Vzorek je poté uložen do speciální vzorkovnice, řádně označen a vybavený žádankou je odeslán do laboratoře. Zde jsou vzorky seřazeny podle klíče, umožňujícího rychlou identifikaci vzorku v kterékoliv fázi vyšetření.
Pro vlastní odběr 0,5 g tkáně k vyšetření metodou Western blot se zvolí jedna polovina prodloužené míchy v regio obex, druhá polovina je zachována pro případné konfirmační imunohistochemické vyšetření. Vzorek mozkové tkáně je poté uložen v původní vzorkovnici při teplotě 3 až 5°C až do ukončení vyšetření.
Speciální kovová či plastová lžíce určená k odběru mozkové tkáně
První pozitivní výsledek testu Western blot ze 4. 6. 2001 s typickou strukturou PrPSc
Výsledek opakovaného vyšetření pozitivního vzorku z 5. 6. 2001 s dvojnásobným nanesením vyšetřovaného materiálu (2 x 2 stopy)
Kvůli věrohodnosti se musí dle předpisů pozitivní vyšetření opakovat a to konfirmačním (kontrolním) imunohistochemickém vyšetřením.
Zde jsou pro porovnání negativní a pozitivní výsledky konfirmační imunohistochemické a histopatologické vyšetření.( zvětšení negativního vzorku a zvětšení pozitivního vzorku)
Obr.1.:Negativní mozková tkáň
obr.2.: Pozitivní mozková tkáň( tzv. „Dušejovské šílené krávy“)
BSE
Vypracoval: Jan Kucharovič
Seznam zkratek použitých v textu:
BSE…………………..bovidní spongoformní encefalopatie
TSE…………………..transmition spogoformní encefalopatie
CJD…………………..Creutzfeld-Jakobova nemoc
PrPC………………….celulární prionový protein
PrPSc…………………patologická izoforma prionového proteinu
SAF………………….Scrapie-associated fibrilis(obdoba BSE u ovcí)
Zdroj, ze kterého jsem čerpal:
Písemná atestační práce vč.popisu prvního případu BSE v České republice.
Autor: MVDr. František Kostka
Maturita.cz - referát (verze pro snadný tisk)
http://www.maturita.cz/referaty/referat.asp?id=6717